流式细胞术实验原理

待测样品(如细胞、染色体、精子或细菌等)经荧光染料染色后制成样品悬液，在一定压力下通过壳液包围的进样管而进入流动室，排成单列的细胞，由流动室的喷嘴喷出而成为细胞液流，并与入射激光束相交。细胞被激发而产生荧光，由放在与入射的激光束和细胞液流成 90°处的光学系统收集之。光学系统中的阻断滤片用于阻挡激发光；二色分光镜及另一些阻断滤片则用于选择荧光波长。荧光检测器为光电倍增管。散射光检测器是光电二极管，用以收集前向散射光。小角度前向散射与细胞大小有关。

整个仪器用多道脉冲高度分析器处理荧光脉冲信号和光散射信号。测定的结果用单参数直方图、双参数散点图、三维立体图和轮廓（等高）图来表示。

对细胞进行分选的原理是，由超声振荡器产生高频振荡，使流动室发生振动，把喷嘴喷出的细胞液流断裂成一连串的均匀小液滴，有的液滴含有细胞。这些细胞在形成液滴前，光学系统已测定了它们的信号（代表细胞的性质），如果测得信号与所选定的要进行分选的细胞性质符合，或者说，如果发现了要进行分选的细胞时则在这个选定细胞刚形成液滴时，仪器给整个液流充以短暂的正或负电荷。当该液滴离开液流后，其中被选定细胞的液滴就带有电荷，而不被选定的细胞液滴则不带电。带有正电或负电的液滴通过高压偏转板时发生向阴极或向阳极的偏转，从而达到了分类收集细胞的目的。

1、检测指标：
DNA倍体分析、DNA含量分析、细胞周期、细胞凋亡；细胞表面抗原分析：淋巴细胞免疫分型、白血病及淋巴瘤免疫分型、血小板相关抗体分析、PNH相关抗原检测（CD55/CD59）、胞内细胞因子检测等。

2、样本及来源：
  1) 细胞数量达到检测所需（细胞周期1x10⁶、细胞凋亡3x10⁶）,生长良好，无污染，附有细胞生长照片，注明实验检测项目所需试剂盒；来源于人、小鼠、大鼠或其它。
  2) 外周血：EDTA或肝素抗凝全血，5ml左右；来源于人、小鼠、大鼠或其它。
  3）试剂：部分常用荧光探针，如PI等，我公司可免费提供；特殊标记物，如CD抗体等，用户须另行购买，我公司可以代购；用户所提供抗体应可与样本发生特异性识别反应。
  4）样品包装要求：细胞培养在培养瓶中或操作前样本于合适的条件保存。

检测说明：
1、用户需要进行流式细胞仪检测时须提前预约，同时说明实验目的、方法等。最低收费300元。
2、我公司在正式接受实验委托一周内交付实验结果。所提供实验结果忠实于样本的实际情况。
3、用户须一次性全额预付实验费。
4、由用户提供的样品或试剂所致的实验问题由用户负责。
5、请在表中说明检测具体要求，由于填写资料不详所致任何问题由用户负责。
6、请在送样的同时提供样本来源及处理方法等信息，样品检测后原则上本公司不负责保存。

附：流式细胞术检测样品推荐制备方法
A. 直接标记抗体（FITC标记抗体）：
  (1)收集1×10⁶个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。
  (2)用4%多.聚.甲.醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。
  (3)用1ml含5% 人血清的 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗体(5×10⁵个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。加入200ul 1% 多.聚.甲.醛固定，待测即可。
  (4)用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10,000.00个细胞。

B. 未标记抗体间接免疫荧光标记法：
  (1)收集2×10⁶个细胞，用冷的PBS 2ml 洗涤细胞一次，800rpm离心5min。
  (2)用2ml 4%多.聚.甲.醛室温固定细胞40min,800rpm离心5min；2ml PBS重悬细胞，800rpm离心5min；
  (3)用1ml含0.2%Triton-X100和5%血清的PBS重悬细胞，冰上放置10min,800rpm离心5min。
  (4)加入饱和剂量未标记抗体，冰上放置40min,800rpm离心5min，用2ml冷的PBS 重悬细胞，800rpm离心5min，洗去未结合一抗，重复一次。
  (5)加入荧光标记（FITC）标记的二抗，冰上避光放置40min后，800rpm离心5min，去上清，PBS洗涤两次。
  (6)加入0.5ml 1%多.聚.甲.醛重悬细胞；固定待测。
  (7)流式细胞仪检测荧光值,每管计数10,000.00个细胞。

C.细胞周期、细胞凋亡及DNA倍体分析样品（PI染色）的制备：
  (1)待测样本制成单细胞悬液，然后200g离心5分钟，弃上清。
  (2)用4℃预冷的70%冷乙醇固定，4℃保存，至少固定18小时。
  (3)调整细胞浓度为106细胞/毫升，取1毫升细胞悬液，用PBS洗三次，细胞重悬于1毫升PI染液中，37℃孵育30分钟即可进行流式分析。
  (4)PI染液终浓度为50微克/毫升，RNase A终浓度为20微克/毫升。