细胞表面分子抗原的流式荧光检测是最常用的细胞分析方法之一。美国 eBioscience 公司为小鼠、人和大鼠 CD 分子和其它膜分子提供了近乎完全的荧光标记抗体和纯化抗体，成为实验者研究工作的完美解决方案。

一、实验材料

检测管（如： Falcon Cat.No.2008 ）或 96 微孔板（ Falcon Cat.No.3910 ）

一抗（标记或纯化）

• Anti-CD16/32 抗体用于封闭 Fc 片段造成的非特异结合干扰（可选）

荧光二抗（间接标记染色）

缓冲液： eBioscience FC Staining Buffer （ Cat.No.00-4222 ）或 PBS （ PH7.4 ）

设备：移液器、离心机、冰盒或冰箱、流式细胞仪

二、注意事项

1. 抗体在使用之前迅速离心几秒，使所有的液体都集中到管底。

2. 尽量避免直标抗体之间的聚集。

3. 抗体应避光 4 ℃ 保存，避免冻结。

4. 样本的固定保存或较长时间放置可能会影响细胞表面分子和抗体之间的结合，故建议尽可能使用新鲜样品.

三、操作方法

A ．小鼠淋巴组织细胞表面抗原的流式检测步骤

（一） 样品制备

1. 取出小鼠淋巴组织块，迅速浸泡在 10ml 的 Staining Buffer 中，并用注射器的活塞研磨或使用两块预冷的载玻片研压成单细胞。

2. 把悬液转移到 50ml 的锥形管中静置片刻，使细胞团块和碎片沉降到管底，并通过尼龙网 ( 如 Falcon Cat. No. 2350) 过滤成单细胞悬液。

3. 4 ℃ 下300-400g离心4-5分钟，弃去上清液。

4. 如果该样品为脾脏细胞，加入一定量的RBC lysis裂解红细胞，或者用分离液分离出淋巴细胞。若为其它样品，略去此步骤。

5. 加入50ml staining Buffer 重悬细胞后计数，根据需要用 台盼蓝(Trypan Blue)进行细胞活性检测。

6. 离心细胞液并弃去上清；用适量的 Staining Buffer 重悬细胞为 2 × 107 个 /ml 。若采用直接标记的一抗，则加入 CD16/32 抗体（ 0.5-1ug/106 细胞）冰上孵育 5-10 分钟。

（二） 细胞荧光染色步骤

1. 在每个流式检测管或板式微孔中加入 50ul 的稀释后的一抗（抗体用 Staining Buffer 稀释成合适的浓度）；在空白管 / 孔或同型对照管 / 孔中加入 50ul Staining Buffer 。若进行抗体最佳浓度测试，建议范围 2-0.03ug/106 细胞。

2. 在各管 / 孔中分别加入 50ul 细胞悬液（约 106 细胞），并轻轻混匀。

3. 避光 冰浴或在4℃冰箱中孵育20分钟。

（注：有些抗体可能需要更长的孵育时间，建议实验者进行预试验摸索）

4. 孵育完成后，加入 Staining Buffer （每流式检测管中加 2ml ，而每微孔中加 200ul ）

5. 4 ℃ 下300-400g离心5分钟，并弃去上清。

6. 重复洗涤过程3次。

7. 重悬细胞后上流式仪检测。

a) 若使用的一抗是荧光直接标记抗体，用500ul Staining Buffer 重悬细胞后上机检测。

b) 若使用的一抗是纯化或生物素标记抗体，则每管/孔加入50-100ul稀释好的荧光标记二抗或荧光标记亲和素（用 Staining Buffer 稀释成合适的浓度）后于 冰浴或在4℃冰箱中 避光 孵育15-30分钟。洗涤细胞两次（参考第4步和第5步方法）。之后500ul Staining Buffer 重悬细胞，并上机检测。

8. 试验结果分析。

（注：若要对多个细胞表面抗原进行多色标记，则同时加入荧光标记抗体后按以上操作步骤进行孵育和细胞洗涤；操作尽量保持在避光和 4 ℃ 左右的温度下进行。）

B ．人外周血细胞表面抗原的流式检测步骤

1. 在每个流式检测管或板式微孔中加入 50ul 的荧光标记或生物素标稀释后的一抗（抗体用 Staining Buffer 稀释成合适的浓度）；在空白管 / 孔或同型对照管 / 孔中加入 50ul Staining Buffer 。（ eBioscience 公司 tests 规格抗体为即用型抗体，每个检测管中加入 20ul 该类抗体）

2. 每管分别加入 100ul 全血，并轻轻混匀。

3. 室温避光 孵育15-30分钟。

（注：有些结合能力较低的抗体可能需要更长的孵育时间，建议实验者进行预试验摸索）

4. 每管分别加入 2ml RBC lysis Buffer （之前预热恢复至室温），混合均匀。

5. 室温避光 孵育10分钟，此孵育时间不要超过15分钟。

6. 室温 300-400g 离心5分钟，并弃去上清。

7. 用2ml Staining Buffer 洗涤细胞一次。

8. 重悬细胞后上流式仪检测。

a) 若使用的一抗是荧光直接标记抗体，用500ul Staining Buffer 或 2% 的多聚J醛固定液重悬细胞后上机检测。

b) 若使用的一抗是纯化或生物素标记抗体，则每管/孔加入50-100ul稀释好的荧光标记二抗或荧光标记亲和素（用 Staining Buffer 稀释成合适的浓度）后于 室温 避光 孵育15-30分钟。洗涤细胞1-2次（参考第7步方法）。之后500ul Staining Buffer 或 2% 的多聚J醛固定液重悬细胞，并上机检测。

9. 试验结果分析。

（注：若要对多个细胞表面抗原进行多色标记，则同时加入荧光标记抗体后按以上操作步骤进行孵育和细胞洗涤；操作尽量保持在避光条件下进行。）