TUNEL凋亡显色法

TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）法检测细胞凋亡的原理是当细胞发生凋亡时，DNA内切酶被激活，核小体间的基因组DNA被切断，暴露的3'-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）加上带有生物素（Biotin）标记的dUTP即Biotin-dUTP,随后于辣根过氧化物酶（HRP）标记的streptavidin结合，在HRP的催化下通过DAB显色来显示凋亡细胞，从而可以通过普通光学显微镜检测到细胞凋亡。

实验意义

1. TUNEL法是一种分子生物学与形态学相结合的研究方法，可对完整的单个凋亡细胞或者凋亡小体进行原位染色，可以准确反映细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征。

2. 可用于石蜡切片、冰冻切片、培养的细胞等进行细胞凋亡检测，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学方法要高。

3. 操作简便快捷，在细胞凋亡的研究中被广泛采用。

实验步骤

1.石蜡切片TUNEL显色法：

①石蜡切片常规脱蜡至水，脱蜡剂二甲苯，至水剂乙醇；

②PBS漂洗3×5 min；

③加入蛋白酶K工作液37℃反应15-30 min, PBS漂洗3×5 min；

④4%多.聚.甲.醛（pH7.4的PBS）室温固定15-30 min，PBS漂洗3×5 min；

⑤浸入封闭液（3%H2O2）室温封闭10 min，PBS漂洗3×5 min；

⑥加入适量TdT酶反应液，暗湿盒中37℃反应1 h，用SSC室温15 min终止反应后,PBS漂洗3×5 min；

⑦浸入0.3% H2O2封闭内源性过氧化物酶活性，室温孵育3-5 min，PBS漂洗3×5 min；

⑧滴加Streptavidin-HRP工作液，37℃反应30-60 min，PBS漂洗3×5 min；

⑨滴加DAB显色液后用去离子水漂洗数次；

⑩选择是否用DAPI复染细胞核；

?脱水、透明、中性树胶封片后进行观察。

2.冰冻切片TUNEL显色法：

①新鲜组织经处理后，立即在恒冷冰冻切片机内切片，厚度为5~6 μm；

②防脱玻片，贴片，室温阴干约12 h；

③4%多.聚.甲.醛（pH7.4的PBS）室温固定10 min，PBS漂洗3×5 min；

④浸入封闭液（3%H2O2）室温封闭10 min，PBS漂洗3×5 min；

⑤浸入通透液（0.1%Triton X-100溶于PBS中），室温通透30 S-2 min；

⑥加入适量TdT酶反应液，暗湿盒中37℃反应1 h，用SSC室温15 min终止反应后,PBS漂洗3×5 min；

⑦浸入0.3% H2O2封闭内源性过氧化物酶活性，室温孵育3-5 min，PBS漂洗3×5 min；

⑧滴加Streptavidin-HRP工作液，37℃反应30-60 min，PBS漂洗3×5 min；

⑨滴加DAB显色液后用去离子水漂洗数次；

⑩选择是否用DAPI复染细胞核；

?脱水、透明、中性树胶封片后进行观察。

实验完成周期及交付标准

1. 实验周期：1-2周

2. 交付标准：蜡块、切片、染色图片、实验报告（实验步骤、试剂、耗材等）

需确认的信息

1. 样本的种属

2. 样本的类型（固定的组织or蜡块or切片）

3. 是否提供试剂盒

4. 拍照要求