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DNA怎么裂解?裂解的试剂主要有哪些?

发布者:admin发布时间:2022-06-09浏览量:返回上级


裂解方法包括化学裂解、酶裂解和机械裂解。化学裂解和酶裂解通常是比较温和的方法,通常会很少使DNA断裂。这几种方法是提取纯化DNA中常用的方法。机械裂解可以更均一的裂解细胞,同化学裂解相比,机械处理具有更高的裂解效率和更低的选择性。机械处理可以更剧烈和全面的裂解细胞,但也会造成DNA的断裂.一、机械裂解法主要有以下两种:


1.热休克(Thermalshock),既反复冻溶法,是一种常用的机械裂解方式比,通常由冷冻和解冻两部分组成(freezingandthawing),。原理:由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。冷冻通常在液氮或-20℃冰上进行,解冻可以在37、50、65或100℃水浴中进热休克比化学裂解温和,但是很有效,有资料表明用热休克和溶菌酶与SDS的方法获得了90%的细胞裂解率。


2.超声波处理(Ultrasonication)既利用超声加热的方法,把细胞破碎。但这种处理会导致DNA的断裂,所以加热不宜过剧烈,要设定好超声时间和间隙时间,一般超声时间不超过5秒,间隙时间最好大于超声时间,这些都有利于保护酶的活性。bead-beating也是常用的机械处理方式,有报道指出bead-beating比热休克和化学裂解的细胞裂解效果更好虽然DNA产量较高,但通常得到的DNA片段较小。


二、化学裂解和酶裂解法(在提核酸时联合使用)主要是裂解液处理法,细胞裂解液的主要目的有以下几种:(1)利用去污剂破坏脂质双分子层,破裂细胞;(2)溶解蛋白;(3)蛋白变性使其稳定;(4)抑制蛋白酶活性。细胞裂解中常用的试剂有:50mMTris-HClpH7.4(缓冲体系),150mMNaCl(等渗体系),1mMPMSF(强大的蛋白酶抑制剂),1mMEDTA(变性剂和稳定剂),5µg/mlAprotinin(蛋白酶抑制剂),5µg/mlLeupeptin(蛋白酶抑制剂),1%Tritonx-100(破坏细胞),1%Sodiumdeoxycholate(中度变性剂和蛋白溶解剂),0.1%SDS(强变性剂和蛋白溶解剂)。7M尿素,2M硫脲(可以提高膜蛋白的融解),蛋白酶K等.也可以直接在我司购买实验室DNA、RNA、原代细胞裂解物等,无需进行繁琐的细胞培养和裂解,到手就可以上实验。

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