蛋白鉴定-蛋白双向电泳2D-WB

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蛋白鉴定-蛋白双向电泳2D-WB

发布者：admin发布时间：2022-06-09浏览量：返回上级

实验技术简介
2D-WB是双向电泳与传统western blot结合而成的一项技术。一般实验流程为抗原蛋白混合物先经双向电泳分离，然后将凝胶蛋白转印至支持膜上，再通过抗体杂交显色。2D-WB技术可以检测到抗原等电点或分子量发生的微小变化，在蛋白翻译后修饰的研究中有很好的应用；而2D-WB结合质谱鉴定技术，可以从蛋白混合物中找到免疫原性更强的抗原。

2D Western blot概述
2D-WB是双向电泳与传统western blot结合而成的一项技术。一般实验流程为抗原蛋白混合物先经双向电泳分离，然后将凝胶蛋白转印至支持膜上，再通过抗体杂交显色。2D-WB技术可以检测到抗原等电点或分子量发生的微小变化，在蛋白翻译后修饰的研究中有很好的应用；而2D-WB结合质谱鉴定技术，可以从蛋白混合物中找到免疫原性更强的抗原。

2D Western blot技术服务内容
1、蛋白质抽提与定量；
2、双向电泳；
3、转膜，封闭，孵育，显示成像。

实验操作流程
1、第一项电泳（IEF），胶条平衡，第二项电泳SDS-APGE。
2、第二项电泳结束后，取出凝胶进行转膜，转膜方法可选择湿法转移和半干法转移。常用的膜是NC膜和PVDF膜。
3、封闭, 5%脱脂奶粉或5% BSA封闭1小时（室温）或过夜（4度）。
4、一抗孵育,根据抗体说明书选择孵育时间，常规的孵育条件是室温1小时或4度过夜，一抗孵育后取出膜TBST洗涤3次，每次5分钟。
5、二抗孵育：根据一抗选择合适的二抗（抗鼠、抗人、抗兔等），室温孵育1小时后取出膜TBST洗涤3次，每次5分钟。
6、显影：将A、B底物按比例稀释混合均匀后滴在膜上，暗室中将胶片置于膜上，盖上压片夹，曝光一定时间后将胶片放入显影液中进行显影，直到出现清晰的蛋白质条带，清水漂洗一下后在定影液中定影，曝光时间需综合考虑蛋白质的上样量，抗体稀释浓度，抗体孵育时间等因素。
7、定影后，清洗胶片，晾干，标定marker，扫描图片和 2D Western blot图片分析。

送样须知：

为了保证2D Western blot技术服务能顺利进行，样品寄送需满足以下要求：

1、顾客提供：组织、细胞、蛋白质溶液等；一抗（可交由晶莱公司代购）。
2、运输要求：干冰或液氮包装寄送，北京、长沙客户可上门取样。
注：样本应避免各类污染和反复冻融。

2D Western blot技术服务报告内容
1、蛋白质定量结果及电泳上样量；
2、原始胶片、电子图片及图片分析结果；
3、2D Western blot完整的实验报告,包括实验步骤、使用仪器和试剂等。

附：2D Western blot实验步骤
1、2D Western blot蛋白质样本制备,制备的主要原则是尽可能溶解全部蛋白质，破坏蛋白质与蛋白质间的相互作用，避免各类干扰物质，样品制备与IEF兼容等。
2、双向电泳的主要步骤，第一项电（IEF），胶条平衡，第二项电泳SDS-APGE。
3、第二项电泳结束后，取出凝胶进行转膜，转膜方法可选择湿法转移和半干法转移。常用的膜是NC膜和PVDF膜。
4、封闭, 5%脱脂奶粉或5% BSA封闭1小时（室温）或过夜（4度）。
5、一抗孵育,根据抗体说明书选择孵育时间，常规的孵育条件是室温1小时或4度过夜，一抗孵育后取出膜TBST洗涤3次，每次5分钟。
6、二抗孵育：根据一抗选择合适的二抗（抗鼠、抗人、抗兔等），室温孵育1小时后取出膜TBST洗涤3次，每次5分钟。
7、显影：将A、B底物按比例稀释混合均匀后滴在膜上，暗室中将胶片置于膜上，盖上压片夹，曝光一定时间后将胶片放入显影液中进行显影，直到出现清晰的蛋白质条带，清水漂洗一下后在定影液中定影，曝光时间需综合考虑蛋白质的上样量，抗体稀释浓度，抗体孵育时间等因素。
8、定影后，清洗胶片，晾干，标定marker，扫描图片和2D Western blot图片分析。

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服务范围SCOPE OF SERVICES

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