体外细胞培养的一个重要原则是需模拟体内细胞生长环境，该模拟系统中最重要的核心因素是细胞与培养环境之间的相互作用。不同于传统的二维单层细胞培养，三维干细胞培养技术(three-dimensional cell culture，TDCC，简称3D培养)是指通过细胞聚集建立细胞球或将细胞嵌入支架上或支架内来模拟真实生物体组织的ECM（细胞外基质），进而在一定程度上模拟体内微环境。3D培养技术既能保留体内细胞微环境的物质及结构基础，又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势。

3D细胞培养技术很多，但总结起来主要可分为3类：

1.3D水凝胶

水凝胶是水膨胀性的高分子网络，被设计用来模拟复杂的细胞外微环境。水凝胶由水、ECM蛋白和生长因子组成。用于三维细胞培养的第一代水凝胶是从小鼠肉瘤细胞基底膜提取的ECM聚合物。

举例：ECM凝胶

从小鼠肉瘤细胞基底膜提取的天然ECM，可以提供非常丰富的营养，与细胞的发育具有高度兼容性。ECM的主要组分是层粘连蛋白、IV型胶原、蛋白多糖硫酸乙酰肝素和巢蛋白。这种水凝胶聚合物可通过20-40°C热激活，凝胶化过程也是可逆的(蛋白质浓度:8–12mg/ml)。

BME中培养16天后，对MCF-10A细胞进行染色：

A）细胞染色试剂盒（结构）；B）细胞核；C）线粒体膜电位；

BME中培养12天后，对PC-3细胞进行染色：

D）CalceinAM（细胞活力）；E）CPA染料1（细胞核）；F）线粒体膜电位

2.细胞聚集

基于细胞聚集的方法不需要额外添加细胞外基质蛋白，细胞会产生内源的细胞外基质蛋白并不断聚集形成较大的聚集体。由此形成的球体大小和组分取决于起始细胞数量、孵育时间和细胞增殖率等因素。

举例：悬滴培养板

3D悬滴培养平板的孔板经过特殊设计，当在小孔上方加入一滴细胞悬液时，孔板的几何构造就会引导细胞和培养基通过一个小洞，进而形成一个稳定的悬滴。滴入口位于每个培养孔的上方，可用来更换培养基，添加外源胞外基质、生长因子、小分子，也可用来加入细胞形成混合培养物。

3.培养支架

支架可提供一种物理支撑，细胞可以进入支架生长和行使功能。孔隙分布、暴露平面区域和孔隙度具有关键作用，其数量和分布会影响细胞渗透入支架的效率，而依据不同的制作工艺，支架具有不同的结构、随机或定制的孔隙分布。